以DNA做為支架的酶會(huì)表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特性；然而，這種現(xiàn)象背后的機(jī)制仍舊有待探究。我們使用凝血酶研究這個(gè)問(wèn)題，該酶是變構(gòu)調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶模型，以獨(dú)體的結(jié)構(gòu)和電荷特征嵌入DNA折紙結(jié)構(gòu)（稱為DNA Origami)。底物僅在電荷不同時(shí)，我們比較酶對(duì)底物的水解活性，該電荷不同是由于遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)的末端殘基引起，推測(cè)該差異涉及到凝血酶的變構(gòu)活性。我們的數(shù)據(jù)表明，酶促反應(yīng)速率受DNA/底物電荷互作的影響，與DNA/酶的連接程度成比例。當(dāng)與自由擴(kuò)散的酶相比，帶有相反電荷的底物，將會(huì)導(dǎo)致以DNA為支架的凝血酶的催化應(yīng)答產(chǎn)生轉(zhuǎn)變。因此，通過(guò)改變嵌入酶周圍的電荷環(huán)境的方式，DNA納米結(jié)構(gòu)賦予了酶-底物識(shí)別的電荷依賴性機(jī)制，可以用于為通過(guò)空間限制調(diào)節(jié)變構(gòu)的過(guò)程提供一種替代性的方法。

01

背景介紹

核酸，尤其是DNA，通常用于分離，重組以及，一般來(lái)說(shuō)，控制蛋白的活性，以揭示自然機(jī)制，便于為我們所用。在關(guān)于DNA-酶系統(tǒng)中的大量發(fā)現(xiàn)中，一個(gè)共同的事實(shí)是：當(dāng)一個(gè)酶分子與核酸連接，催化反應(yīng)的速率便發(fā)生改變。這種現(xiàn)象，最初被發(fā)現(xiàn)是在二十年前，隨著DNA納米技術(shù)的進(jìn)步，雖進(jìn)一步被研究，但是仍舊缺少綜合性的解釋。關(guān)于這個(gè)方向的報(bào)道，大多數(shù)都強(qiáng)調(diào)一旦酶和DNA納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，酶的催化活性便被提高。然而，早期的關(guān)于DNA-酶復(fù)合物的研究展示了相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酶與DNA結(jié)合后，催化速率將產(chǎn)生下降。在這兩種不同的結(jié)果中，改變的程度不僅受DNA鏈序列和長(zhǎng)度的影響，而且受到酶和底物類型的影響，因此問(wèn)題也變得更加復(fù)雜。另一種相關(guān)性是，目前為止，關(guān)于這個(gè)問(wèn)題的大多數(shù)研究進(jìn)展都采用酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（通常為葡萄糖氧化酶/辣根過(guò)氧化物酶）和DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合的方式。參與級(jí)聯(lián)反應(yīng)的組分以納米級(jí)別的精確度被整合在DNA表面，提供了一種手段，用于將系統(tǒng)中的酶活性表現(xiàn)與其中各成分之間的距離聯(lián)系起來(lái)。在較短的酶內(nèi)空間下觀察到的速率增加，可歸因于底物通道效應(yīng)的發(fā)生。

其他研究則表明，DNA 表面所產(chǎn)生的靜電效應(yīng)對(duì)于酶的固定起到了重要作用，并提出了其他可能的解釋，這些解釋在底物擴(kuò)散速率競(jìng)爭(zhēng)性較高的情況下尤其適用。

完善的機(jī)制仍舊很難描繪，多種假說(shuō)已經(jīng)提出來(lái)用于解釋DNA-酶的催化活性表現(xiàn)。這些包括DNA鏈和酶和/或底物的直接互作；在蛋白催化位附近提高底物的局部濃度，或者是有利的熵貢獻(xiàn)的結(jié)果，或者是靜電荷驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)；PH梯度的形成；或者是DNA-蛋白界面有序的水化層的形成。所有這些假設(shè)均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；然而，DNA對(duì)與單鏈DNA連接的酶的活性作用仍舊沒(méi)有完全揭示，并且難以進(jìn)行概括。

當(dāng)下，我們使用凝血酶作為問(wèn)題研究的模型。凝血酶是膽汁肽酶家族中的單體絲氨酸蛋白酶，能夠裂解肽底物，尤其是在堿性殘基，大多數(shù)是精氨酸殘基后發(fā)揮作用。兩個(gè)遠(yuǎn)離催化中心的次級(jí)陰離子結(jié)合位點(diǎn)是提高底物的特異性所必須的，合成的核酸適配體以nmol級(jí)別的親和性與這些表位結(jié)合。我們使用與凝血酶結(jié)合的適配體將凝血酶連接到各種DNA納米結(jié)構(gòu)上。這種方法已經(jīng)被廣泛的報(bào)道，提供了一種通過(guò)非共價(jià)連接將酶固定到靶向支架的方式。這種方式能夠繞過(guò)DNA-蛋白共價(jià)結(jié)合帶來(lái)的共同問(wèn)題，比如樣本的異質(zhì)性，蛋白表面永久的化學(xué)修飾，這些都可能造成酶結(jié)構(gòu)和功能不可預(yù)知的改變。最后，由于我們的系統(tǒng)是由每個(gè) DNA 支架上的單個(gè)酶分子構(gòu)成的，多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中那些與距離相關(guān)的參數(shù)變得不再適用了，簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)分析，并且能夠深入探討關(guān)于DNA限制型酶促催化這一核心問(wèn)題。

凝血酶的獨(dú)特之處在于，在稍有不同的條件下，其催化反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)出多種表現(xiàn)形式，這種可塑性被解釋為一種高度受調(diào)控的別構(gòu)激活機(jī)制所導(dǎo)致的結(jié)果。鹽例子類型和濃度，緩沖液的pH值以及與凝血酶表位相互作用的肽底物的末端殘基的輕微改變都會(huì)導(dǎo)致Kcat值超過(guò)100倍的變化，KM值發(fā)生三個(gè)數(shù)量級(jí)的變化。由于對(duì)結(jié)構(gòu)和電荷相關(guān)因素極為敏感，因此凝血酶是檢驗(yàn) DNA 在離子響應(yīng)性酶反應(yīng)中的支架作用和靜電作用的理想選擇，正如那些被多種絲氨酸蛋白酶所調(diào)節(jié)的那樣。這些DNA相關(guān)的效應(yīng)在動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的系統(tǒng)中仍舊不清楚，對(duì)其的深入理解在開(kāi)發(fā)酶活性調(diào)節(jié)的替代性工具上因而十分重要。

通過(guò)在不同緩沖液條件和DNA微環(huán)境下對(duì)凝血酶催化不同肽底物的系統(tǒng)性研究，我們?cè)诒疚闹忻枋隽薉NA在變構(gòu)調(diào)節(jié)的單體蛋白酶動(dòng)力學(xué)中的復(fù)合作用。我們的分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了結(jié)構(gòu)上的解釋，并支持了我們關(guān)于 DNA 在凝血酶催化機(jī)制中發(fā)揮積極作用的觀點(diǎn)。應(yīng)用過(guò)渡態(tài)模型能夠量化反應(yīng)在不同情況下的能量分布變化，并為將這些變化轉(zhuǎn)化為不同底物濃度下反應(yīng)速度的變化提供了關(guān)鍵手段。我們認(rèn)為，DNA納米桿不僅僅做為一個(gè)被動(dòng)的支架，它們通過(guò)為底物水解提供可替代性路徑而積極參與到催化循環(huán)中。最終的結(jié)果是一個(gè)由一系列催化反應(yīng)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，游離的和與 DNA 結(jié)合的酶在動(dòng)力學(xué)上是相互關(guān)聯(lián)的，并且由 DNA 引導(dǎo)的物質(zhì)流動(dòng)量會(huì)與 DNA/酶結(jié)合的親和力以及 DNA/底物的靜電相互作用成正比地增加。

02

結(jié)果

1、DNA-酶結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

在我們所有的樣本中，a-人凝血酶在核酸適配體存在與否下水解熒光標(biāo)記的肽底物，核酸適配體或者自由擴(kuò)散到溶液中，或者錨定到固定形狀的DNA origami支架上（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1A)。因此，整個(gè)系統(tǒng)都可以看作由三個(gè)元素構(gòu)成：酶，底物和DNA微環(huán)境，必須考慮相互作用，才能理解在DNA限制環(huán)境中發(fā)生的催化反應(yīng)的復(fù)雜性。酶是該系統(tǒng)中的唯一恒定成分，其它的兩種則會(huì)以一定的方式進(jìn)行變化，以理解它們?cè)诖呋磻?yīng)動(dòng)力學(xué)中單獨(dú)或互相結(jié)合的作用。我們使用了三種不同的肽底物，其序列為 FAM-GGfPR|SGGGK(BHQ-1)K-Aaa-OH（其中 f 表示 d-苯丙氨酸殘基，Aaa 是可變氨基酸；請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1B)。

所有底物都帶有一個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移報(bào)告基團(tuán)（[5-carboxyfluorescein/black hole quencher 1 (FAM/ BHQ-1)]，供體和淬滅熒光基團(tuán)分別位于肽的P5和P5’的位置。在裂解位點(diǎn)（由豎線表示）處，由凝血酶引發(fā)的底物水解會(huì)導(dǎo)致染料在空間上分離，并使熒光猝滅現(xiàn)象消失。供體熒光信號(hào)的增加便可用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)在時(shí)間上的進(jìn)展情況。三種底物僅在C-末端氨基酸上有所不同：此處分別各自為一個(gè) Gly, Asp, 或Lys，在PH為7時(shí)，靜電荷分別為中性（0），負(fù)電荷（-1）或正電荷（+1）。相應(yīng)地，三種底物分別表示為S(0），S(-1)和S(+1)。

系統(tǒng)中另外的可變因素是DNA微環(huán)境。這種系統(tǒng)性的改變可用于評(píng)估不同的結(jié)構(gòu)和電荷因素對(duì)酶/底物催化效應(yīng)的影響。

具體來(lái)說(shuō)，我們使用序列為5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′的含15個(gè)堿基的凝血酶結(jié)合適配體TBA1和序列為5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’含29個(gè)堿基的適配體TBA2各自識(shí)別凝血酶的exosite I和II位點(diǎn)（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1B)。帶有單鏈延伸部分（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1A中淺藍(lán)色和深藍(lán)色的線段）的適配體的拉長(zhǎng)部分與 DNA 皺折表面（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1A中棕色部分）建立了連接。已設(shè)計(jì)出兩種類型的 DNA 納米結(jié)構(gòu)：?jiǎn)螌涌蚣軜?biāo)記為“矩形”；請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1C）和雙層立方形狀（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 1E）。

Fig. 1 DNA origami-凝血酶催化系統(tǒng)

2、DNA對(duì)凝血酶催化水解的效應(yīng)

在1nM核酸適配體存在與否的情況下，檢測(cè)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。一旦添加底物（從0到25M)，通過(guò)由于底物裂解產(chǎn)生的隨時(shí)間變化的熒光信號(hào)對(duì)酶的裂解活性進(jìn)行測(cè)量（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2D)。所有的實(shí)驗(yàn)都在同樣的條件下進(jìn)行，每個(gè)底物共14個(gè)不同的蛋白水解反應(yīng)。動(dòng)力學(xué)檢測(cè)圖譜請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2C。凝血酶通過(guò)三步機(jī)制催化氨基鍵水解，底物的結(jié)合（K1）和解離（K-1）后緊接著是不可逆的乙?；约叭ヒ阴；↘3）步驟（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2B)。我們所有的速率曲線都符合MM等式（Eq. 1)，高濃度底物時(shí)，與DNA Origami-結(jié)合的酶受到明顯的抑制（texS2)。除了rect flex 1(Fig. 2C中的黃色曲線），在所有經(jīng)過(guò)直角和矩形修飾的結(jié)構(gòu)中都會(huì)出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?5uM時(shí)，其速度曲線會(huì)呈現(xiàn)出輕微的負(fù)斜率這一特征（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 2C)。

Fig. 2 凝血酶催化底物S(0）水解的動(dòng)力學(xué)分析

仔細(xì)分析由底物S(0)產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，尤其是KM（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 3C)，可以區(qū)分出三類樣本，這取決于是否存在 DNA 以及其與酶的結(jié)合程度。這三類樣本分別被命名為“無(wú) DNA”、“未結(jié)合 DNA”和“結(jié)合 DNA”。與其他兩組相比，“無(wú)DNA“組共同的特征是DNA的缺失，產(chǎn)生相似的KM（3.4 ± 0.2M）和Kcat（65 ± 4 min?1）值。“DNA未結(jié)合組”中酶的運(yùn)動(dòng)仍舊相對(duì)自由，盡管被大量的DNA包圍著，這種DNA指的是隨意的單鏈寡核苷酸序列形式或缺少核酸適配體的DNA Origami結(jié)構(gòu)，酶的KM值減少了40%（2.0 ± 0.1 M）以及Kcat值平均高了15%（80 ± 21 min?1）。最后，第三組結(jié)構(gòu)中，酶是固定在DNA Origami結(jié)構(gòu)中，該組中的酶具有更低的KM值(1.1 ± 0.2 M) 以及平均值上更高的Kcat值 (100 ± 14 min?1 )。

假設(shè)采用一個(gè)簡(jiǎn)單的MM模型，我們接著運(yùn)用過(guò)渡態(tài)理論將反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與參與反應(yīng)的物質(zhì)在反應(yīng)路徑上所經(jīng)歷的能量變化聯(lián)系了起來(lái)（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4)。

Fig. 3 凝血酶催化三種底物水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3、物的靜電荷對(duì)凝血酶動(dòng)力學(xué)效應(yīng)

我們使用S(-1)和S(+1)底物進(jìn)行了同樣的酶催化檢測(cè)（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 3,A,B,E,和F）。盡管與凝血酶結(jié)合的位點(diǎn)相同，我們期望這些含有不同靜電荷的底物具有不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與 S(0) 相比，在沒(méi)有 DNA 納米結(jié)構(gòu)的情況下，底物 S(?1) 的水解反應(yīng)中，K M值（約為 9 uM）和 Kat值（約為 200 min?1）均顯著增加了三倍以上，而底物 S(+1) 的相應(yīng)值則明顯更低（分別為約 0.5uM和45 min?1）。同樣，應(yīng)用過(guò)渡態(tài)模型有助于從能量角度來(lái)解釋這一現(xiàn)象（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4）。具體而言，在沒(méi)有 DNA 的情況下，向底物中添加負(fù)電荷（即將底物 S(0) 替換為 S(?1)），會(huì)使 ES 復(fù)合物的穩(wěn)定性略微降低，而過(guò)渡態(tài)幾乎保持不變。與之相反，正電荷的添加，例如將底物S(0)替換為S(+1)，產(chǎn)生相反的結(jié)果，它將會(huì)使ES復(fù)合物和過(guò)渡態(tài)更加穩(wěn)定，并且前者比后者更加穩(wěn)定。仔細(xì)研究底物靜電荷對(duì)DNA限制性反應(yīng)的能量水平的影響也非常具有指導(dǎo)性意義（請(qǐng)見(jiàn)Fig. 4)。當(dāng)將 S(0) 替換為 S(?1) 時(shí)，與沒(méi)有 DNA 存在時(shí)所觀察到的相同趨勢(shì)出現(xiàn)了一致的情況，因此，可以得出類似的結(jié)論。而 S(+1) 的表現(xiàn)則完全不同：在此情況下，由于周圍存在 DNA環(huán)境而產(chǎn)生的正電荷的加入，極大地破壞了 ES 復(fù)合物的穩(wěn)定性，使得過(guò)渡態(tài)幾乎未受影響。這導(dǎo)致了 KM 和 kcat 的顯著增加，而 Kcat /KM 的值幾乎未受影響。

Fig. 4 S（-1）、S（0）和 S（+1）與凝血酶以及與 DNA 連接的凝血酶的反應(yīng)能量圖

本文中，凝血酶與DNA的結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)量，采用的是switchSENSE技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在存在大量單鏈 DNA (ssDNA)的情況下，凝血酶仍能保持其結(jié)合特異性。