斑馬魚基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用，不得用于臨床診斷 規(guī)格：48T/96T

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本試劑盒用于測(cè)定斑馬魚血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中斑馬魚基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)水平。用純化的斑馬魚基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)，再與HRP標(biāo)記的基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中斑馬魚基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)濃度。

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量1g，加入9ml的PBS、PH7.4，勻漿的比例1:9，勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。離心20分鐘左右（3000-5000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。

6.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

需自備的儀器耗材：

1.酶標(biāo)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

操作步驟：

1、加樣：標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)定5個(gè)濃度點(diǎn)10個(gè)孔，每個(gè)濃度設(shè)定平行孔，加入50μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔設(shè)定1個(gè)孔加入50μl蒸餾水（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

2、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

3、配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

4、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

6、溫育：操作同2。

7、洗滌：操作同4。

8、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

9、終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

10、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)，測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.98以上。

2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

檢測(cè)范圍：

10 ng/mL - 650 ng/mL

靈敏度：

最低檢測(cè)濃度小于 1 ng/mL

保存條件及有效期：

1. 試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期： 6個(gè)月