脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）活性測(cè)定試劑盒

分光光度法 50管/24樣

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

LOX廣泛存在于動(dòng)植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化。在生物體的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。

測(cè)定原理：

LOX催化亞油酸氧化，氧化產(chǎn)物在280nm處有特征吸收峰；測(cè)定280nm吸光度增加速率，來計(jì)算LOX活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。

生化試劑盒的通用測(cè)定步驟可分為 前期準(zhǔn)備、試劑配制、參數(shù)設(shè)置、校準(zhǔn)與質(zhì)控、樣本檢測(cè)、結(jié)果計(jì)算 六大核心環(huán)節(jié)，具體細(xì)節(jié)如下：

一、前期準(zhǔn)備

1. 試劑準(zhǔn)備：檢查試劑盒各組分（R1、R2、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等）是否齊全、無異常（如渾濁、沉淀、變色），按要求從儲(chǔ)存環(huán)境取出，平衡至室溫（通常 20~25℃，平衡時(shí)間 5~30 分鐘，具體以試劑盒說明為準(zhǔn)），輕輕搖勻備用。

2. 樣本準(zhǔn)備：確認(rèn)待檢測(cè)樣本類型符合要求，已按規(guī)范完成采集與處理（如血清 / 血漿樣本離心分離、組織勻漿制備、尿液離心去沉淀等）；若樣本需稀釋或預(yù)處理（如去除干擾物），提前完成相關(guān)操作。

3. 儀器準(zhǔn)備：確認(rèn)使用的生化分析儀 / 酶標(biāo)儀等儀器符合試劑盒適用要求，提前開機(jī)預(yù)熱，進(jìn)行儀器清潔（避免殘留污染），準(zhǔn)備好所需耗材（如反應(yīng)杯、移液槍頭）。

二、試劑配制（如適用）

1. 即用型試劑：無需額外配制，平衡至室溫后直接使用。

2. 需混合試劑：按試劑盒規(guī)定比例（如 R1:R2=4:1、3:1 等）準(zhǔn)確混合試劑組分，現(xiàn)配現(xiàn)用，避免提前配制導(dǎo)致試劑失效。

3. 校準(zhǔn)品配制：用指定稀釋液（如試劑盒配套稀釋液、生理鹽水）將校準(zhǔn)品稀釋至所需濃度梯度（通常 3~5 個(gè)梯度，如 0、20、40、80、160 nmol/L），稀釋后充分搖勻備用。

三、儀器參數(shù)設(shè)置

根據(jù)試劑盒要求及所用儀器型號(hào)，設(shè)置核心檢測(cè)參數(shù)：

1. 基礎(chǔ)參數(shù)：檢測(cè)方法（終點(diǎn)法、速率法、兩點(diǎn)法等）、孵育溫度（通常 37℃）、反應(yīng)時(shí)間（含孵育時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間）。

2. 波長參數(shù)：主檢測(cè)波長（如 450 nm、540 nm，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物特征吸收峰確定），若存在背景干擾，需設(shè)置副波長進(jìn)行校正。

3. 液量參數(shù)：明確試劑與樣本的比例（如 R1 200 μL + 樣本 20 μL，孵育后加 R2 50 μL），確保移液體積準(zhǔn)確。

四、校準(zhǔn)與質(zhì)量控制（保障結(jié)果準(zhǔn)確性）

1. 校準(zhǔn)程序：將配制好的各濃度梯度校準(zhǔn)品依次加入反應(yīng)杯，按設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，記錄各校準(zhǔn)品的吸光度值 / 吸光度變化率；以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X 軸）、對(duì)應(yīng)吸光度相關(guān)值為縱坐標(biāo)（Y 軸），采用指定擬合方式（如線性回歸、Spline 擬合）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求相關(guān)系數(shù) R2≥0.990（具體以試劑盒性能指標(biāo)為準(zhǔn)）。

2. 質(zhì)控程序：同步測(cè)定高、中、低三個(gè)水平的質(zhì)控品，檢測(cè)完成后查看質(zhì)控結(jié)果是否在規(guī)定靶值范圍內(nèi)；若超出范圍，需排查試劑、儀器、操作等環(huán)節(jié)問題，解決后重新進(jìn)行校準(zhǔn)與質(zhì)控。

五、樣本檢測(cè)

1. 按儀器參數(shù)設(shè)定的試劑 / 樣本比例，依次向反應(yīng)杯加入對(duì)應(yīng)試劑和待檢測(cè)樣本，確保加樣順序正確（如先加 R1 和樣本，孵育后再加 R2）。

2. 按規(guī)定的孵育溫度和時(shí)間完成反應(yīng)，避免反應(yīng)不充分或過度反應(yīng)。

3. 反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)讀取各樣本的吸光度值 / 吸光度變化率，記錄原始數(shù)據(jù)。

六、結(jié)果計(jì)算與記錄

1. 依據(jù)繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合樣本的吸光度相關(guān)值，自動(dòng)或手動(dòng)計(jì)算樣本中被測(cè)物的濃度 / 活性（如公式：被測(cè)物濃度 =（樣本吸光度值 - 空白吸光度值）× 校準(zhǔn)品濃度 /（校準(zhǔn)品吸光度值 - 空白吸光度值））。

2. 記錄檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)標(biāo)注校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、質(zhì)控結(jié)果等關(guān)鍵信息，便于后續(xù)結(jié)果追溯與驗(yàn)證。

注意事項(xiàng)：