在細胞培養(yǎng)過程中，溶氧（DO）是影響細胞生長、代謝和產(chǎn)物合成的關(guān)鍵工藝參數(shù)。無論是細菌還是細胞培養(yǎng)的生物反應器控制過程中，氧氣是維持細胞生存必不可少的條件之一。細胞依賴氧氣進行有氧呼吸，以生成能量（ATP）并支持增殖，而溶氧不足會導致細胞代謝轉(zhuǎn)向無氧途徑，積累乳酸等副產(chǎn)物，引發(fā)pH波動和細胞凋亡。在生物反應器的過程控制中，主要利用反應器的MFC模塊通過通氣管路向培養(yǎng)物中通純氧來維持細胞培養(yǎng)過程中所需的氧氣，細胞以溶氧 (DO) 的形式吸收氧氣。溶氧可以通過兩種方式提供進入培養(yǎng)基：1. 通過反應器的表通，氧氣可以在反應器頂部向培養(yǎng)液表面進行氣體交換。2. 氧氣通過底部通氣鼓泡供應，以微泡和大泡的形式提供不同效率的溶解氧，并通過對流攪拌溶解在培養(yǎng)基中。

圖1 根據(jù)雙膜理論進行氣液氧傳質(zhì)

在細胞培養(yǎng)過程中，溶氧（Dissolved Oxygen, DO）和氧分壓（Oxygen Partial Pressure, pO?）是密切關(guān)聯(lián)但不同的兩個概念，它們的區(qū)別主要體現(xiàn)在定義、單位和實際應用上。

· 溶氧DO：指溶解在培養(yǎng)液中的氧氣濃度，表示單位體積液體中氧氣的含量（如質(zhì)量或摩爾數(shù)）。單位：常用mg/L、ppm（1 mg/L ≈ 1 ppm）或mM（毫摩爾/升）。能夠直接反應在細胞培養(yǎng)物中，細胞生長實際可用的氧氣量，是液相中真正溶解的氧分子的絕對量，更加直觀地反映出培養(yǎng)液中的氧的“含量”，但是含量受培養(yǎng)物的成分、溫度以及壓力等因素的影響。

· 氧分壓pO?：指氣相或液相中氧氣在混合氣體（如空氣）中的分壓，反映氧氣的熱力學活性，與氧傳遞速率（OTR）直接相關(guān)。單位：常用mmHg、kPa或%空氣飽和度（如 20% O?對應約 21 kPa）。能夠描述氧氣在氣液兩相的傳遞驅(qū)動力，與亨利定律相關(guān)。

在細胞培養(yǎng)的生物反應器中，大部分在線電極傳感器所監(jiān)測并體現(xiàn)出來的參數(shù)即是溶解氧，作為在細胞培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵工藝參數(shù)；而氧分壓主要常用于過程控制和監(jiān)測。在線傳感器（如熒光或電化學探頭）可實時監(jiān)測DO，結(jié)合反饋控制系統(tǒng)優(yōu)化供氧效率。因此，溶氧的穩(wěn)定調(diào)控是確保細胞培養(yǎng)工藝穩(wěn)健性和產(chǎn)物一致性的核心要素。

pO?的計算方法：

1. 亨利定律：pO?與溶解氧濃度（DO）的關(guān)系可通過亨利定律描述：

C = KH ? p

C：氣體在液相中的平衡濃度（如溶氧DO，單位：mol/L、mg/L或ppm）

KH ：亨利常數(shù)（Henry's constant），與氣體種類、溶劑性質(zhì)、溫度相關(guān)。單位：通常為 mol/(L·atm) 或 mg/(L·atm)。

p：氣相中該氣體的分壓（如氧分壓pO?，單位：atm、kPa或mmHg）

比如一個大氣壓下，氧的平衡分壓是101.325*20.947%=21.22455kPa，25攝氏度時氧在水中的亨利系數(shù)為4.44*10^6 (kPa),則求出此溫度下氧氣在水中的濃度為:

21.22455*/(4.44*10^6)= 0.00000478

水在不同溫度下的密度可以查相關(guān)資料,25攝氏度時為997.044g/L,每升水的摩爾數(shù)為:

997.044/18=55.39mol

近似認為水中氧的摩爾數(shù)為0.00000478*55.39=0.002648mol

氧的分子量為32g/mol,水中溶解的氧為0.002648*32=0.00847g=8.47mg

即1個大氣壓,25攝氏度時水中溶解氧為8.47mg/L

在CHO細胞培養(yǎng)的過程中，反應器溶氧控制水平需根據(jù)細胞類型和培養(yǎng)階段精準控制，溶氧水平通常保持在10-80%之間。過高的氧濃度會導致活性氧 (ROS) 的積累，導致線粒體呼吸鏈和細胞內(nèi)氧化還原的改變，最終導致細胞生長抑制和特異性生產(chǎn)力下降。另一方面，低氧條件也會誘導 ROS 積累，抑制細胞生長。因此，在一般實驗室規(guī)?；蛘呱a(chǎn)規(guī)模中，DO的設(shè)置常常為40%。VeronicaRestelli等在2.4/4L的培養(yǎng)體系中研究了3、10、50、100和200%的DO對細胞生長、蛋白產(chǎn)量及糖基化的影響，采用CHO-K1細胞系合成促紅細胞生成素(EPO)。

編輯

圖2 在不同 DO 濃度下獲得的比生產(chǎn)率與在 50% 空氣飽和度下為對照獲得的平均比活性相比。偏差表示根據(jù) 50%DO 的四個單獨實驗計算的 SE。* 表示值明顯低于對照值。

Kunkel等研究了DO對IgG半乳糖化的影響，通過將 DO 設(shè)定點控制在 1–100% 空氣飽和度之間，免疫球蛋白 （IgG） 的末端半乳糖基化發(fā)生了顯著變化，二乳糖基化聚糖 （G2） 從高氧水平下的 30% 逐漸降低到低氧條件下的 12% 左右。

圖3 溶解氧對lgG糖型譜的影響。在三種不同溶解氧條件下細胞生長后，顯示無半乳糖基化(G0)、單半乳糖基化(G1)和雙半乳糖基化(G2)糖苷的比例

Andy A. Lin and William M. Miller等研究了在低氧條件下 CHO-K1 細胞耗氧量的調(diào)節(jié)和谷胱甘肽水平的調(diào)節(jié)。報告了由于長時間缺氧或缺氧暴露而導致的耗氧量抑制和供應依賴性關(guān)系的改變。抑制的特征是pO2/50（氧消耗達到最大值一半時的氧張力）值的增加（耗氧量為最大一半時的氧張力）。在長期缺氧的情況下，細胞使用氧氣的潛力也會降低。在低氧條件下葡萄糖消耗量升高可能導致呼吸抑制。谷胱甘肽濃度在整個缺氧暴露過程中保持不變，但在缺氧下可能會降低多達 40%。當維持于細胞毒性水平的氧 （93%） 時，低氧和缺氧細胞中的谷胱甘肽水平分別比對照細胞增加 2 倍和 4 倍。這表明缺氧和缺氧暴露使 CHO 細胞對氧化應激敏感。

dC/dt = kLa ? (C*-CL) = OTR – OUR

氧傳質(zhì)發(fā)生在氣液兩相界面，低部通氣的管路將純氧或者空氣通過微孔噴射到培養(yǎng)液中，根據(jù)攪拌槳的設(shè)計不同，將通入的氣泡打散均勻的擴散給細胞提供氧氣。液體介質(zhì)中氧濃度的變化速率取決于 kLa 以及當前可能氧濃度 （CL） 與最大可能氧濃度（或有時稱為平衡 – C*）之間的差值。同時，氧濃度變化的速率等于氧轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基的速率 （OTR） 與細胞對氧攝取速率 （OUR） 之間的差值。如果 OTR 高于 OUR 項，介質(zhì)將不可避免地被氧氣飽和，直到達到平衡濃度。另一方面，如果其中 OUR 項大于 OTR，氧濃度將低于所需的水平，將不適合細胞正常生長。

圖4 生物反應器中的氧氣傳質(zhì)

OTR 和 OUR 與氧傳質(zhì)系數(shù) kLa 相關(guān)?；谄湎嚓P(guān)性的 OTR 決定了細胞培養(yǎng)中可以達到的最高理論細胞密度。Naveenganesh Muralidharan, Emma Bolduc等人在20000L攪拌式反應器中進行氧傳質(zhì)與剪切力的表征實驗，為高細胞密度培養(yǎng)工藝放大提供理論依據(jù)與實踐指導。通過建立預測模型，可準確評估生物反應器支持的最大細胞密度，并優(yōu)化操作參數(shù)以平衡氧氣傳遞與剪切力控制。在實際系統(tǒng)中， kLa 可以相對容易地測量，如當生物反應器運行中的氧氣濃度恒定時，可使用穩(wěn)態(tài)方法，即測量進入生物反應器的氣流和流出生物反應器的氣流中的氧氣濃度，兩個測量的濃度之間的差異等于氧氣從氣體到液體的傳輸速率?；蛘?，當生物反應器中的氧濃度隨時間變化時，使用動態(tài)方法，在此實驗過程中，通過用氮氣脫氣使氧氣濃度為零，隨后用空氣代替氮氣并測量氧氣濃度隨時間的升高，測量 DO 濃度的變化率。

圖5 電極的結(jié)構(gòu)

DO電極的使用常常分為極譜式溶氧電極和光學溶氧電極。

極譜式溶氧電極原理：兩極間加恒定電壓，電子由陰極流向陽極，產(chǎn)生擴散電流；一定溫度下，擴散電流與溶解氧濃度成正比；建立電流與溶解氧濃度的定量關(guān)系；儀器將電流計讀數(shù)自動轉(zhuǎn)換為溶解氧濃度，并在屏幕上顯示溶解氧值。

在直流極化電壓作用下，溶解在水中的氧氣穿過半透膜到達陰極發(fā)生還原反應，而陽極發(fā)生氧化反應，根據(jù)電化學過程產(chǎn)生的電流強度計算出氧分壓，再根據(jù)亨利定律輸出溶液中的溶解氧濃度。

圖7 光學溶氧電極原理

參考文獻:

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